樣本保存方法及冷凍脅迫對(duì)蝗蟲(chóng)基因組DNA提取的影響

以亞洲小車(chē)蝗為研究材料，提出了使用液氮保存蝗蟲(chóng)樣本的有效方法，并用基因組DNA提取試劑盒分別對(duì)液氮速凍后保存、直接冷凍、無(wú)水乙醇保存和干制蝗蟲(chóng)標(biāo)本進(jìn)行了基因組DNA的提取和電泳檢測(cè)。

　　1材料與方法

　　1.1供試?yán)ハx(chóng)

　　本試驗(yàn)研究的昆蟲(chóng)樣本為亞洲小車(chē)蝗成蟲(chóng)，均采自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟多倫縣農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)草原，用養(yǎng)蟲(chóng)籠活體帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理保存。液氮罐廠家

　　1.2液氮速凍處理

　　取10頭活的亞洲小車(chē)蝗單頭裝入離心管中，將離心管放入液氮中速凍處理3min，取出后在室溫條件下放置12h觀察亞洲小車(chē)蝗存活情況。

　　1.3樣本保存方法

　　1.3.1液氮速凍后保存

　　將采集帶回實(shí)驗(yàn)室的活體蝗蟲(chóng)樣本單頭裝入離心管中，將離心管放入液氮中速凍處理3min，取出后放入-40℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br />
　　1.3.2直接冷凍保存

　　將采集帶回實(shí)驗(yàn)室的活體蝗蟲(chóng)樣本單頭裝入離心管中，直接放入-40℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br />
　　1.3.3乙醇保存

　　將采集帶回實(shí)驗(yàn)室的活體蝗蟲(chóng)樣本放入無(wú)水乙醇(分析純)中保存?zhèn)溆谩?br />
　　1.3.4干制標(biāo)本

　　將采集帶回來(lái)的活體亞洲小車(chē)蝗樣本放入毒瓶中毒死后，針插保存于標(biāo)本室中，待風(fēng)干后進(jìn)行DNA提取試驗(yàn)。

　　1.4DNA的提取

　　將上述4種方法保存的蝗蟲(chóng)樣本在3個(gè)月后進(jìn)行DNA提取試驗(yàn)。分別選用單頭亞洲小車(chē)蝗的后足股節(jié)，無(wú)水乙醇(分析純)保存的蝗蟲(chóng)后足股節(jié)需在提取之前先用無(wú)菌去離子水沖洗2～3次，將蝗蟲(chóng)股節(jié)放入研缽中用液氮研磨成粉并移入1.5mL離心管中，然后使用天根dp304動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒參照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行基因組DNA提取。

　　1.5DNA電泳檢測(cè)

　　用1%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的蝗蟲(chóng)基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)。取DNA樣品3μL、上樣緩沖液2μL混勻后加入凝膠時(shí)預(yù)留的點(diǎn)樣孔中，加入DL2000Marker(TaKaRa;第3條帶為150ng/μL)，經(jīng)過(guò)100V恒壓電泳20min，使用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察基因組DNA提取情況并拍照保存。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1液氮速凍處理對(duì)樣本保存的影響

　　液氮速凍處理的10頭亞洲小車(chē)蝗樣本在12h內(nèi)均無(wú)存活跡象。說(shuō)明通過(guò)液氮速凍處理能夠使亞洲小車(chē)蝗活體樣本迅速死亡，從而消除因逆境脅迫造成的樣本本身生理生化變化，避免了這些變化對(duì)蝗蟲(chóng)樣本基因組DNA提取產(chǎn)生可能的不利影響。

　　2.2不同保存方法對(duì)基因組DNA提取影響

　　亞洲小車(chē)蝗經(jīng)基因組DNA提取后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1～3。液氮速凍后保存和無(wú)水乙醇保存的樣本提取的基因組DNA電泳條帶清晰，說(shuō)明得到的DNA濃度較大;直接冷凍保存的樣本提取的DNA電泳檢測(cè)結(jié)果顯示條帶整齊，但亮度較低，說(shuō)明得到的DNA濃度較小;蝗蟲(chóng)干標(biāo)本提取的基因組DNA電泳檢測(cè)顯示條帶不清楚，并有明顯拖尾現(xiàn)象，有的甚至看不到條帶，說(shuō)明干制標(biāo)本保存會(huì)導(dǎo)致蝗蟲(chóng)基因組DNA發(fā)生嚴(yán)重降解，會(huì)對(duì)下一步基因擴(kuò)增、分子標(biāo)記等分子生物學(xué)試驗(yàn)的進(jìn)行造成不利的影響。液氮罐廠家

[液氮速凍實(shí)驗(yàn)對(duì)照.png]

　　2.3冷凍脅迫對(duì)基因組DNA提取影響

　　對(duì)比液氮速凍后保存和直接冷凍保存兩種樣本保存方法對(duì)蝗蟲(chóng)基因組DNA提取結(jié)果可以看出，液氮速凍后保存的樣本提取的基因組DNA明顯比直接冷凍保存的樣本基因組DNA的電泳條帶亮度高，說(shuō)明液氮速凍后保存得到的DNA的濃度較大。由此得出，樣本在受到冷凍脅迫死亡的過(guò)程中會(huì)發(fā)生基因組DNA降解現(xiàn)象，使提取得到的DNA的濃度較小。所以，液氮速凍后保存更適合昆蟲(chóng)基因組學(xué)的研究。

　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：在保存3個(gè)月后，檢測(cè)蝗蟲(chóng)樣本直接冷凍法和干標(biāo)本提取的總DNA濃度較低，因而瓊脂糖電泳檢測(cè)亮度低;液氮速凍后保存和無(wú)水乙醇保存的蝗蟲(chóng)樣本提取的基因組DNA濃度大。表明液氮速凍后保存和無(wú)水乙醇保存的標(biāo)本適合用于基因組學(xué)研究。通過(guò)對(duì)比，直接冷凍保存與液氮速凍保存結(jié)果得出，蝗蟲(chóng)在冷凍脅迫死亡的過(guò)程中有DNA降解發(fā)生。